Раскрытие процесса расщепления ДНК ферментом Sau3AI

Sau3AI представляет собой фермент рестрикции типа II, широко используемый для генетических манипуляций, таких как создание библиотек геномов. Sau3AI состоит из двух доменов: N-концевого домена (Sau3AI-N) и C-концевого домена (Sau3AI-C). Как эти два домена работают вместе, разрезая ДНК, остается неясным.

Недавно исследовательская группа под руководством профессора Ю Фэна из Шанхайского института перспективных исследований (SARI) Китайской академии наук и профессора Х.Э. Цзяньхуа из Уханьского университета сообщила о механизме самоактивации, при котором С-концевой домен Sau3AI открывает N-концевой каталитический домен посредством аллостерических эффектов для достижения расщепления ДНК-специфичных сайтов.

Результаты были опубликованы в журнале Structure 30 августа.

Из-за активности расщепления ДНК Sau3AI не может экспрессироваться в Escherichia coli, поэтому для экзогенной экспрессии и структурных исследований был использован мутант каталитического сайта Sau3AI-E64A. Кристаллическая структура мутанта Sau3AI-E64A показывает, что, когда ДНК не связана, область петли (333-342) C-концевого домена нависает над сайтом связывания ДНК N-концевого домена, предотвращая связывание N-концевого домена с ДНК.

Анализ структуры С-концевого домена Sau3AI и структуры ДНК-комплекса показал, что область петли (261-268 и 280-295) С-концевого домена значительно изменилась после связывания с ДНК, что означает, что Sau3AI может претерпевать конформационные изменения после С-концевого домена. домен связывается с ДНК.

Кроме того, исследователи провели эксперимент по сдвигу геля на мутантах ключевых аминокислотных остатков ДНК (K257A, S424A и T435A) в С-концевом домене, чтобы подтвердить, что С-концевая связывающая ДНК играет решающую роль в активации каталитической активности N- терминальный домен. Эти результаты позволяют предположить, что С-концевой домен активирует ферментативную активность N-концевого домена посредством аллостерических эффектов.

Исследователи предположили, что Sau3AI является ферментом рестрикции типа IIE, но в отличие от других ферментов рестрикции типа IIE, он является мономерным, а не гомодимерным. Два разных домена в Sau3AI играют сходную роль с гомодимерами в других ферментах рестрикции типа IIE, что позволяет предположить, что Sau3AI представляет собой новый подкласс ферментов рестрикции типа IIE.